Fraunhofer entwickelt neuartige zellbasierte Testsysteme

Fraunhofer entwickelt neuartige zellbasierte Testsysteme


Posted by yklopping on February 10, 2012

Eine kostengünstige, kompakte Methode zur Zweiphotonen-induzierten Vernetzung ermöglicht die Erforschung aussagekräftiger In-vitro-Testsysteme und biomimetischer Ansätze.


Ein Modell für ein elastisches Kapillargefäß wird mit einem Röhrchen erzeugt, das einen Innendurchmesser von nur 20 µm besitzt.Wenn Gewebe durch eine Erkrankung oder einen Unfall stark geschädigt ist oder entfernt werden muss, kann der Körper dieses Gewebe oft nicht selbstständig regenerieren. Häufig steht auch für Transplantationen nicht genügend körpereigenes Material zur Verfügung. Deshalb fordern Mediziner zunehmend einen Gewebeersatz, der eine vollständige Regeneration ermöglicht. In einer ersten Entwicklungsstufe sollen künstlich erzeugte Weichgewebe zum Ersatz von Tierversuchen, wie diese in der pharmazeutischen Forschung, sowie in der Testung neuer Chemikalien heute durchgeführt werden müssen, herangezogen werden. Auch diese Anwendungen benötigen künstliches Gewebe, das seinem natürlichen Vorbild so nahe wie möglich kommt.

Durch einen biomimetischen, also der Natur nachempfundenen Ansatz, sollen aussagekräftige und verlässliche In-vitro-Testsysteme konstruiert werden, die in einer weiterentwickelten Form auch als personalisierte, künstliche Implantate für Patienten bereit gestellt werden können. Da Weichgewebe ein komplexes dreidimensionales System, bestehend aus verschiedenen Zelltypen, Proteinen und biologisch aktiven Substanzen ist, müssen mehrere Aspekte in einem biomimetischen Ansatz berücksichtigt werden.

Ein hohler Polymerzylinder stützt eine frei hängende Proteinmembran. Die Öffnung in der Vorderseite des Zylinders ermöglicht das Spülen der Struktur.Die mechanischen Eigenschaften des die Zellen umgebenden Gewebes haben großen Einfluss auf Funktion und Verhalten der Zellen. So können sich Vorläuferzellen je nach Härte und Elastizität ihrer Umgebung in Knochen, Knorpel oder Fettgewebe entwickeln. Ein „aussagekräftiges“ und hochgradig kontrollierbares In-vitro-Testsystem sollte diese mechanische Sensibilität berücksichtigen, jedoch werden die meisten Zellexperimente in normalen, inelastischen Polystyren-Petrischalen durchgeführt.

Die komplexe, dreidimensionale Struktur von Gewebe ist ein wichtiger Aspekt, der die Funktionalität der Zellen bestimmt. Im Falle von Weichgewebe wird das Verhalten der Zellen durch Proteine der Extrazellulären Matrix wie Kollagen und Elastin beeinflusst. Nur wenn dieser Einfluss mit erfasst wird, entsteht ein aussagekräftiges Modell. Außerdem sind unterschiedliche Zelltypen spezifisch zueinander angeordnet. Deutlich wird dies am Beispiel der Haut. Haut besteht aus den Schichten Epidermis, Dermis und Subkutis, die jeweils spezielle Funktionen ausüben. Die Epidermis besteht hauptsächlich aus drei Zelltypen, die verschiedene Schutzfunktionen ausüben. So vermitteln Keratinozyten mechanischen Schutz, Melanozyten Schutz vor UV-Strahlung und Langerhans-Zellen Schutz vor Keimen. Die darunter liegende Dermis ist ein festes Bindegewebe und verleiht der Haut ihre Elastizität. Zusätzlich befindet sich hier auch ein stark verzweigtes Kapillarnetz zur Nährstoffversorgung der Zellen. Die Subkutis Eine Zellwand wird aus zwei modifizierten Proteinmaterialien hergestellt. Durch das Hinzufügen einer Proteinmembran an die Spitze der Struktur wird die Nische geschlossen.hingegen ist ein loses Bindegewebe, in dem sensorische Zellen, beispielsweise für den Tastsinn oder auch die Anbindung des Kapillarnetzes an das Blutgefäßsystem liegen. Des Weiteren liegen in Dermis und Subcutis weitere Hautstrukturen wie Schweißdrüsen, Haarwurzeln und Nervenzellen. Diese unterschiedlichen Funktionen und Teile des Gewebes entstehen aus dem Zusammenspiel unterschiedlicher Zelltypen, sowie die sie umgebendee Extrazelluläre Matrix.

Ein tiefes Verständnis der Komplexität der dreidimensionalen mechanischen, strukturellen und biochemischen Umgebung ist also notwendig, um praktikable, technisch umsetzbare Lösungen zu finden. Seit einigen Jahren werden unter dem Schlagwort „3D-Zellkultur“ genau diese Fragestellungen angegangen. Hierfür wurden spezielle Techniken zur Schaffung von kontrollierten dreidimensionalen Umgebungen für die 3D-Zellkultur entwickelt, wie zum Beispiel das Gießen von Protein-Hydrogelen, Kryotechniken zur Präparation schwammartiger Strukturen oder Elektrospinnen zum Herstellen von Vliesen. Obwohl sich diese Techniken für Zellkulturuntersuchungen bewährt haben, ist es bisher nicht möglich, damit dreidimensionale Strukturen aufzubauen. Eine aussichtsreiche Technologie, um die mechanischen, strukturellen und biochemischen Anforderungen zu erfüllen, ist die Zweiphotonen-induzierte Vernetzung (TPC) spezieller Polymerlösungen. Bei der TPC initiiert ein stark fokussierter Laserstrahl in einem Materialbad eine photochemische Reaktion, die zu einer lokalen Vernetzung führt. Hierbei können eine Vielzahl von Materialien verwendet werden, unter anderem synthetische Polymere diverser mechanischer Eigenschaften, sowie Proteine der Extrazellulären Matrix selbst. Durch den nichtlinearen Charakter der TPC lassen sich außerdem noch hohe strukturelle Auflösungen im sub-Mikrometerbereich erzielen. Damit besitzt TPC das Potenzial hochgenaue Mikroumgebungen für die 3D-Zellkultur zu schaffen, die unterschiedliche mechanische, strukturelle und biochemische Randbedingungen simulieren können.

Im Zweiphotonen-induzierten Vernetzungsprozess vernetzt ein stark fokussierter Laserstrahl in einer Polymerlösung eine minimale Menge an Material. Ein daraus resultierendes Volumenelement („Voxel“) misst nur etwa 1 µm Kantenlänge.  Die hohe Auflösung der Technik resultiert aus der nichtlinearen Absorption der Photonen durch speziell dem Material zugesetzte photosensitive Additive. In UV-basierter Photochemie liefert jeweils ein Photon die Energie, die notwendig ist, um ein solches Additiv in einen angeregten Zustand zu überführen, der dann eine Vernetzung des Materials bewirkt. Diese Anregungsenergie wird aber auch durch die gleichzeitige Absorption zweier Photonen der halben notwendigen Energie erreicht. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit dieser Zweiphotonenabsorption sehr viel geringer als für einen Einphotonenprozess. Um mit Hilfe der Zweiphotonenabsorption eine Vernetzung zu initiieren, folgt hieraus, dass das Material für spezifische Laserwellenlängen eine minimale Einphotonenabsorption besitzt – die für Zweiphotonenprozesse benötigten hohen Photonendichten werden typischerweise durch die starke Fokussierung einer ultrakurz gepulsten Laserstrahlquelle erreicht.

Für eine Anwendung der TPC in Bereichen wie 3D-Zellkultur oder der Erzeugung von dreidimensionalen Gewebeimplantaten ist es daher notwendig, Prozesse zu entwickeln, die auf die Vernetzung von biofunktionalem Aufbaumaterial angepasst sind sowie geeignete Maschinen zur Verfügung zu stellen. Mittels TPC ist es möglich, komplexe, hochaufgelöste dreidimensionale Strukturen direkt aus Proteinen der Extrazellulären Matrix zu generieren. Es wurde gezeigt, dass die Proteine nach Vernetzung Teile ihrer Funktion behalten und zum Beispiel gerichtetes Zellwachstum stimulieren. Hinderlich ist jedoch, dass viele Proteine nach Vernetzung eine geringe mechanische Stabilität aufweisen, die die mögliche Strukturkomplexität negativ beeinflusst. Um dieses Problem zu umgehen ist es möglich, Hybridstrukturen zu generieren, bei denen synthetische Polymere ein stabiles mechanisches Gerüst für die Proteinmikrostrukturen darstellen. Mittels dieser Technik können freihängende Proteinmembranen erzeugt werden.

Der Großteil der in der Literatur beschriebenen experimentellen TPC-Anlagen besitzen eine große Bauform, verwenden kostspielige Femtosekundenlaser und haben ein Arbeitsvolumen, das kleiner als etwa 1 mm3 ist. Basierend auf kostengünstigen Lasersystemen größerer Pulslänge vereint der Prototyp des Fraunhofer ILT zum einen eine kompakte Bauform mit einer Kantenlänge von 40 cm, mit einem Arbeitsfeld von 25 mm x 25 mm. Die Probe muss während der Strukturierung nicht bewegt werden, da der fokussierte Laserstrahl in alle drei Raumrichtungen bewegt werden kann. Das eröffnet neue Möglichkeiten, wie etwa die Inkorporation der TPC in komplexe biotechnische Anlagen. Darüber hinaus erlaubt die kompakte Bauform eine Prozessführung unter sterilen Bedingungen in normalen biologischen Werkbänken.

 

Sascha Engelhardt, Dipl.-Phys., ist Wissenschaftler am Fraunhofer ILT
Steinbachstraße 15
52074 Aachen
Tel. +49 241 8906 605
E-Mail: sascha.engelhardt@ilt.fraunhofer.de
www.ilt.fraunhofer.de

 

 

 



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